如何判定荧光定量结果的真实性？ 第1页

如果你说的是荧光定量PCR的话：

根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。

典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。

根据所使用的技术不同，荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I 荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。

在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。

定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。

1.终点定量不准确

理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是

S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA

模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的

Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR

反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大【1】。

传统的定量方法，如溴乙锭染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等，测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。

对于绝大多数实验，比如甲肝的诊断、药物疗效的监测等，需要测定的都是PCR放大之前标本中的DNA原始拷贝数，经过PCR扩增以后的DNA拷贝数已经不能反映真实情况。在这种情况下，就不能采用终点定量，而要根据CT值确定DNA起始拷贝的数量。

2. CT值与起始模板拷贝数成线性关系

CT值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。重复实验中可以直观地看到，尽管平台期DNA拷贝数波动很大，CT值却是相对固定的。如果用不同浓度的DNA作PCR，可以看出DNA浓度越高，CT值越小。DNA浓度每增加1倍，CT值减小1个循环。CT值与模板DNA的起始拷贝数成反比.

其数学证明为：

既第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB) 加上每个分子的荧光强度(即单位荧光强度，RS) 与分子数目的乘积，， 是初始目标分子数， 是目标分子扩增效率, 是循环数， 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。

当循环次数时,

两边取对数，得;

整理得：

由上可得，对于每一个特定的PCR反应来说，、、和都是常数，所以值与成反比，也就是说，值与起始模板拷贝数()的对数成反比。

3.数据分析的几个概念【2】：

基线（Baseline）:扩增曲线中的水平部分；

调整原则：如果CT值>18，不需调整，使用自动分析结果；如果CT<18，修改终点，再分析一次；起点一般取3-6，终点一般取12-15.
阈值线（Threshhold）：荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。

手动调节阈值线的原则：要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值.

4.数据分析三部曲

①曲线分析（Amplification Plot）：

该步骤主要是对扩增曲线进行整体或单个的调整，主要包括：对数曲线与线性曲线的转换、模板或内标检测探针的选择、基线的调整、阈值的设定等几个方面。

主要有整体曲线的观察：分析是否存在污染（主要是试剂污染）；分析是否有因物理或其他因素造 成的异常曲线情况；

阴性对照分析：观察是否存在污染；

阳性对照分析：观察是否在质控范围内；

标准品分析：观察标准品分布是否均匀，梯度是否正常，Ct值是否正常。

②标准曲线分析（Standard Curve）

该面板主要用于标准曲线参数的分析，通过对曲线各个参数的统计，可以判断实验定量的准确程度或者试剂的稳定程度。其主要包括三个参数：Slope（斜率）、Intercept（截距）和R2（线性相关性）。