专家认为高温灭活处理使 RNA 降解是造成新冠核酸检测假阴性的原因，是这样吗？ 第1页

56°加热会不会增加新冠病毒检测假阴性概率，这是外行才讨论的问题

今天科技日报的一篇关于《新冠肺炎核酸检测假阴性率为何这么高》的报道被各大媒体刷了屏，报道中采访了南京大学模式动物研究所发育生物学与遗传学教授赵庆顺，他在20号的时候发表了一篇《病毒核酸提取前的高温灭活过程显著降低可检出病毒核酸模板量》的文章挂在了中科院预印本的网站上。^[1]

目前国家卫健委相关指南要求在提取样本核酸前需将样本置于56℃以上以灭活病毒。这一灭活过程无疑是保护临检人员免受病毒暴露所必需，但也会破坏病毒核酸的完整性，导致部分样品不能被正常检出，成为高假阴性率的原因之一。最近，我们以猪 PDEV 冠状病毒（疫苗）作为模型研究了高温灭活过程对病毒核酸完整性的影响。结果表明：保存在常用等渗盐溶液 Hank’s 液中的样品经 56o C 孵育 30 分钟后可检出冠状病毒核酸损坏了一半，而以 92oC 孵育 5分钟，则可检出的冠状病毒核酸损失了 96%以上。当采用一款市售的 R503 样品保存液保存 PEDV 时，经 56oC 孵育 30 分钟后病毒核酸可检出量是 Hank’s 液的3 倍，若是 92oC 孵育 5 分钟，则可检出量是 Hank’s 液的 42 倍。这些结果提示，使用可有效保护样本 RNA 特别是避免样本 RNA 在高温灭活时受损的样品保存液，不但可以让临检人员依然能够在高温灭活后使用样品，还有望提高阳性检出率。

在论文中他提出一个观点，56°30分钟的病毒灭活过程会显著降低样本中病毒模板含量，大概会降低一半，92°会损失96%，而如果采用了一种R503保存液可以有效的增加核酸的检出量。

先说结论，根据论文的内容判断，赵教授很可能是个核酸检测的外行，说了一堆正确的废话。

嫌弃后文太长的我把所有解读都写这里：

1. 因为RNase的存在，RNA在自然条件下保存都不太行，会被降解。
2. 加热会使得RNase的活性增加，所以加热RNA保存液肯定会使降解肯定更严重。
3. 保存病毒不用Hank's溶液，一般为了保存活性我们用UTM溶液。
4. 实验室为了对抗RNase同时保存病毒活性，会加入一种RNA抑制剂的酶，但这玩意很贵还不好保存。
5. 胍盐类的RNA保存液会损害病毒活性，但是不影响核酸检测，而且还便宜（比抑制酶来说），而且同时会灭活病毒，这样就减少了加热灭活环节。

以下是解读过程版本：

高温加热会增加RNA的降解，降低样本检出量，这个是肯定的，使用RNA保存液（论文里提到R503）可以有效的抑制RNA的降解。实验没问题，结论没问题。甚至来说，这都不用做实验，任何一个具有RNA提取或者相关经验的同学都会知道这个结论。

关于病毒样本的采集后的保存，比如咽拭子取样以后，把样品封装装到采样管里。并不是所有的无菌采样管都能用来保存病毒，最少你得有一个RNA样本保存液吧。

教授的论文里提到的Hank‘s保存液是一种平衡盐溶液,主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂基础溶液。实际上，没有人用这玩意保存病毒的，也能看出来赵教授平时不搞这个。

保存一般用的是UTM的保存液。

UTM保存液成分为：Hanks液基础,庆大霉素,真菌抗生素,BSA (V) ,冷冻保护剂、生物缓冲剂及氨基酸等。多种抗生素联合，具有抗细菌和抗真菌的作用。牛血清白蛋白（BSA）作为蛋白质稳定剂，可在病毒的蛋白质外壳形成一种保护膜，使其不易分解，保证病毒的完整性。Hanks缓冲液构建的中性环境，有助于增加病毒的生存时间和感染稳定性。

UTM这种RNA保存液的好处是可以有效的保存病毒的活性。便于后续对病毒分离、培养。但前提是必须低温保存。

搞生物的人都知道RNA这东西是很容易被降解的，RNA酶（RNase）简直就是RNA提取操作的天敌。RNase来源广泛，自然界各种生物（包括人类）都会生产RNase这东西。所以很难保证你采集的样本中不会混入RNase。

RNase这东西别说56度，室温下都会降解RNA，所以我们保存样本都需要4°（短期）或者-70°(中长期)，如果要长期保存RNA病毒得用液氮。很多时候做提取实验都需要复苏后快速裂解样品，甚至在冰上操作才能降低RNA被降解的速度。如果本来样本中采集到的病毒RNA样本少，在被RNase降解一会就更少了，加热到56°后酶的活性提高，92°这个酶都不会变性反而效率会更一步提升，那么降解现象肯定更严重。

那么就没办法了吗？那肯定不能够啊。实验室还有一种RNA样本保存液，其原理是用另外一种酶来抑制RNase的活性，又能保存病毒的活性，还能保护病毒里的RNA免受降解。

比如我们在实验室里采用的RNase Inhibitor（RNA抑制剂），采用的是一种蛋白酶，它可以与RNase结合成一个新的个体，抑制RNase生效，保护了病毒。

但是为啥没有广泛使用这个试剂呢？这玩意本身就是酶，有两个酶的共同特点

1，贵；2不好保存。

随手搜了一发价格，给大家感受一下。

那么问题来了，我们是用来检测样品中是否含有病毒特定核酸的，对病毒的死活并没有要求（不然为什么要加热灭活），所以为什么要保存病毒活性。。。有没有其他的方案既能保存病毒的不被RNase分解，又能物美价廉的？

当然也有，比如胍盐类的RNA样本保存制剂。

胍盐一般有盐酸胍、硝酸胍，氰基胍这类的，这东西可以有效的使得蛋白质变性。RNase也是一种蛋白酶也会被变性，失去它本来的作用。而且大家考虑下病毒外壳也是蛋白质构成的，所以胍盐还能给病毒灭活。还省去了56°加热的过程。

当然问题也来了，这东西会让病毒灭活，你用它保存的病毒以后是没机会培养了，而且不能长期储存，但一般来说，常温一周以内储存还是没问题的，对于我们核酸检测来说，没啥大影响。

赵教授在文章里提到的哪个R503属于抑制RNase的保存剂。我在赵教授提到的公司官网上没看到R503的产品说明，只看到了R501，R502一类的。^[2]但整体说明可以看出，运用这种保存剂可以使用RNA在常温状态下较长时间的保存，即便在加热灭活的过程中，也可以有效的降低RNA被降解的，不太确定是不是胍盐类还是其他类的方式，但是整体来说肯定是抑制了RNase。（教授的文章竟然还验证了这个，也是高手）

新冠病毒能用的RNA保存剂随便找个试剂商都能问到，能灭活的版本也有很多，有胍盐类的也有非胍盐类的，各种试剂商都有售，反正从论文的行文来看里里外外透露出了2个字，外行。

参考

1. ^ http://chinaxiv.org/abs/202002.00034
2. ^ http://www.vazyme.com/product/49.html