中国学者在 3 月 30 日《细胞》杂志上发表论文，首次将神经退行性疾病基因敲入猪，意义有多重大？ 第1页

中国科学家领衔的国际研究团队经过4年努力，利用基因编辑技术（CRISPR/Cas9）和体细胞核移植技术，成功培育出世界首例亨廷顿舞蹈症基因敲入猪，能精准地模拟人类神经退行性疾病。

没看过《豪斯医生》的朋友可能对“亨廷顿舞蹈症”（HD）有些陌生。与它隶属同一家族——神经退行性疾病的另外两位要更大名鼎鼎，阿尔茨海默病(AD)和帕金森病（PD）。

目前它们的治疗十分困难。主要原因有两个：一是不清楚发病机理；一是不知道如何干预才有效。

有多难？说两件事。

2016年11月，美国制药巨头礼来正式宣布投入数十亿美元的solanezumab（针对阿尔茨海默病β淀粉样蛋白的单抗新药）三期临床失败；2018年1月，全球最大制药公司辉瑞宣布将放弃研发治疗阿尔茨海默病和帕金森病的新药。

固然企业的药物研发还受到多种因素的影响，但PD、AD的新药研发屡屡受挫，折射出了整个神经退行性疾病治疗研究的举步维艰。

• “柿子先捡软的捏”，选中亨廷顿舞蹈症

前文提到，亨廷顿舞蹈症与阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症，都是神经退行性疾病。神经退行性疾病伴随年龄渐长而产生、可遗传、呈渐进性发展。

李晓江教授介绍，神经退行性疾病的致病蛋白变异后，沉淀在神经细胞中，造成神经细胞功能紊乱，并引发神经细胞死亡，从而导致疾病发生。

相较于阿尔茨海默病、帕金森病，亨廷顿舞蹈病是由单基因（HTT）突变导致的。这是一个理想的疾病模式，可以研究蛋白质错误折叠是如何引起疾病的。把它研究清楚，就能为多基因突变病症的研究打下基础。

建立准确模拟疾病的动物模型，对开发治疗疾病的有效手段至关重要。

像亨廷顿舞蹈症，虽然致病机理很清楚，但由于此前缺乏合适的动物模型进行药物筛选，目前尚无有效的治疗方法。

• 那么多动物模型，为什么选择猪？

常见的一些动物模型都存在局限性。

（1）神经退行性疾病小鼠模型不够“有效”

小鼠作为最常见的动物模型，已被广泛地用于研究人类疾病机理、寻找临床治疗方法。

然而，研究中发现，表达突变基因的神经退行性疾病小鼠模型，并不能表现出像病人脑中一样的典型神经细胞死亡的重要病理特征。因此，许多有治疗效果的药物在小鼠模型中有效，在临床上对病人却往往无效。

（2）采用传统方法做的猴模型不能将致病基因传代

为了探索与人类更相似的大动物能否更好地模拟神经退行性疾病，在美国Emory大学合作者的支持下，李晓江教授及李世华教授这对科学“夫妻档”2008年就曾成功地将外源性的突变基因引入到猕猴的体内，建立了世界首例转基因亨廷顿舞蹈病的猴模型。

在这个模型中，可以明显地观察到相应的病理特征和行为变化。然而，由于表达外源性致病基因片段的毒性过强，实验中的转基因猴子出生后，基本在较短时间内就死亡了，不能将致病基因传代，严重限制了科学家们对其进一步探索和研究，无法达到筛选治疗疾病的药物的目的。

另外，成熟的克隆猴技术最近才刚刚突破，还有待进一步的技术优化。

（3）猪的疾病模型的优势在哪儿？

与果蝇、线虫、小鼠等小型动物相比，猪被公认为是人类医学研究理想的大动物模型。赖良学教授解释说，猪的心血管系统、消化系统、皮肤、营养需要、骨骼发育以及矿物质代谢等都与人的情况极其相似，猪的体型大小和驯服习性允许进行反复采样和进行各种外科手术。

与非人灵长类动物相比，猪的基因多样、繁殖周期短、一窝产仔多，便于根据特殊需要进行选育。

所以，猪的疾病模型更合适药物筛选、人类疾病研究、评估干细胞治疗的研究结果，更容易转化为临床应用。作为华南地区重要的大动物疾病模型实验平台之一，赖良学团队先后建立了50余种在生物医药和农业领域具有重要价值的转基因和基因打靶克隆猪。

• 怎么做出亨廷顿舞蹈症基因敲入猪？

（1）传统方法做的猪模型，遭遇了和猴模型一样的问题

在基因编辑技术被广泛应用于哺乳动物之前，2010年，李晓江、李世华就找到了赖良学教授，用传统转基因的方法建立了亨廷顿舞蹈症猪模型。

当时的猪模型虽然具有明显的表型特征，但和猴模型一样，不易存活、无法传代。

团队分析，亨廷顿舞蹈症是内源性基因突变而造成的，如果直接把猪的内源性基因定点替换为人类亨廷顿疾病的突变基因，猪的病理变化应该与病人的病理状态更接近。

然而，大动物没有成熟的干细胞培养体系，应用传统方法基因敲入的效率太低，在大动物中很难获得理想结果。

（2）2013年开始，研究团队通力合作，利用基因编辑技术，将人突变的亨廷顿基因插入到猪的内源性亨廷顿基因的表达框中。

（3）利用成纤维细胞筛选出阳性克隆细胞。

这并非一件易事，需要把“单细胞逐个挑出来并进行筛选及鉴定，一定要挑选状态最好的细胞用来胚胎移植”。

负责此项实验工作的闫森先后筛选了上千个细胞，从中挑出确定带有突变基因且状态最好的细胞。闫森说，“每天早上7点进入细胞间，看细胞、换液、不停地跟细胞打交道，一抬头已是下午3点。好不容易筛选到的阳性克隆细胞如果状态不好又得重来，只有大量筛选才能获得最优的细胞克隆。”

（4）体细胞核移植技术，进行克隆

筛选到理想的细胞后，运用体细胞核移植技术进行克隆，成功培育出带有突变基因的新生猪。

在出生5个月后，科学家观察到这种亨廷顿猪出现了运动障碍等渐进性发病的表型。

（5）将稳定表达致病基因的亨廷顿猪繁殖下去

由于疾病模型猪身体状态不好，在传代过程中更需要悉心的照料。

养猪的过程，团队也没少付出心血，为了证明亨廷顿基因敲入猪的病理特征更接近于人类，李世华教授多次从美国返回中国亲自指导实验，去猪场观察小猪的生存环境及生活状态。

在团队的呵护下，稳定遗传的第一代小猪终于出生，实验成功了！

结果证明，该模型不仅能模拟亨廷顿舞蹈症病人在大脑中特异神经元选择性死亡的典型病理特征，还能表现出类似亨廷顿舞蹈病“舞蹈样”的异常行为。更重要的是，这些病理特征及异常行为都可以稳定地遗传给后代。

• 亨廷顿舞蹈症基因敲入猪模型有什么意义？

该研究为开发治疗亨廷顿舞蹈病新手段提供了稳定、可靠的动物模型，也为制备其它神经退行性疾病大动物模型提供了技术范本和理论依据。

从事HD研究多年的权威专家, 美国加州大学洛杉矶分校杨向东(X. William Yang)教授指出，亨廷顿舞蹈病基因敲入猪的建立是神经退行性疾病研究领域中的一个里程碑式的发现, 使科学家能更深入了解神经细胞死亡的机制及寻找有效的治疗方法。

基因编辑猴、克隆猴、猪的疾病模型的研究相继取得重大进展，中国在大动物模型领域的研究真是可喜可贺，这些进展对生物医药产业的发展将提供极大助力。

特别说明：

该项成果的论文共同通讯作者为暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院李晓江教授、中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员、美国Emory大学李世华教授。

文章共同第一作者为暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院闫森副研究员和涂著池博士、中国科学院广州生物医药与健康研究院刘朝明。中山大学、吉林大学、云南农业大学的科学家们也参与了该工作。研究工作得到了国家自然科学基金委、国家重大研究计划、国家重点研发计划以及广东省科技计划的大力支持。

作者：孙小橘 木三子（中国科学院广州生物医药与健康研究院 暨南大学）

出品：科学大院

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